基于早期在免疫療法領(lǐng)域的研究和開發(fā)主要使用的是樹突狀細(xì)胞(DC)治療方法。樹突狀細(xì)胞(DC)通常被認(rèn)為在抗原呈遞細(xì)胞(APC)中是功能性最強的細(xì)胞，且在連接先天性免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面起著關(guān)鍵性作用[4,5]。為了以適當(dāng)方式激活T細(xì)胞進(jìn)行免疫攻擊，樹突狀細(xì)胞(DC)先對抗原進(jìn)行加工隨后在其表面進(jìn)行抗原的表達(dá)，其作用類似于公告牌。這種表達(dá)和活化的步驟經(jīng)常會失去對癌細(xì)胞的識別，這就好比于當(dāng)把癌細(xì)胞視為“自體”時，樹突狀細(xì)胞(DC)不能以適當(dāng)方式處理這種信號。?
為了解決這一問題，很多研究人員已經(jīng)開始研究通過培養(yǎng)單核細(xì)胞、分化出樹突狀細(xì)胞(DC)以及修飾樹突狀細(xì)胞(DC) 在自體外識別腫瘤信號。這樣在重新回輸活化的成熟樹突狀細(xì)胞(DC)時就會激活免疫系統(tǒng)(圖1)[6]。
盡管已有多個早期和晚期臨床試驗使用了這種方法，但目前美國只有一種基于樹突狀細(xì)胞的療法實現(xiàn)商業(yè)化[6]。
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圖1-基于樹突狀細(xì)胞治療的生產(chǎn)[9]。
Provenge?(Sipuleucel-T)于2010年由Dendreon實現(xiàn)商業(yè)化，目前仍用于晚期前列腺癌的治療[7]。近期市場報告預(yù)計，直到2030年“全球樹突狀細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞癌疫苗”的年增長率可達(dá)20.7%[8]。
隨著人們越來越關(guān)注基于細(xì)胞類的藥物產(chǎn)品，為其生產(chǎn)選擇合適的系統(tǒng)和材料變得越來越重要。?
本文將重點介紹在選擇培養(yǎng)容器時需要考慮的材料特性和重要因素。除此之外，在決定和開發(fā)完整的生產(chǎn)工藝時需要考慮上游(如擴(kuò)增)和下游(如采集)的加工培養(yǎng)步驟以及配套材料(如培養(yǎng)基和細(xì)胞因子)也非常關(guān)鍵[10-12]。
單核細(xì)胞到樹突細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的現(xiàn)狀
使用一次性材料進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)可以追溯到20世紀(jì)60年代。最初先是從玻璃培養(yǎng)皿過渡到硬質(zhì)塑料容器(T-Flask)，現(xiàn)在的培養(yǎng)系統(tǒng)則為硬質(zhì)材料和軟塑料系統(tǒng)的動態(tài)混合，并且不斷演化發(fā)展出各種新材料的創(chuàng)新 [13]?
選擇細(xì)胞培養(yǎng)容器時需要考慮的關(guān)鍵材料特性- 透氧性和水蒸汽滲透性
很多因素會影響聚合物的滲透性，包括但不限于：
???? 滲透分子的大小/物理狀態(tài)
???? 聚合物的形態(tài)/性質(zhì)
???? 滲透物的溶解度/擴(kuò)散率
???? 是否存在填料、濕度和增塑劑?
在選擇封閉式培養(yǎng)系統(tǒng)時，包括水蒸汽在內(nèi)的氣體滲透性堪稱最關(guān)鍵的特性。這是由于細(xì)胞需要依靠系統(tǒng)材料的滲透維持適當(dāng)濃度的氧氣(和二氧化碳)并獲得足以限制蒸發(fā)的屏障 - 這些對于細(xì)胞的整體代謝功能至關(guān)重要。?
細(xì)胞培養(yǎng)通常需要使用加濕型培養(yǎng)箱減少細(xì)胞環(huán)境中的水分流失(圖2-4)。
圖2-細(xì)胞呼吸的高水平反應(yīng)[14-16]。
圖3- 細(xì)胞呼吸的高水平反應(yīng)
圖4- 靜態(tài)滲透性培養(yǎng)系統(tǒng)
透明度
透明度是一種用于描述光線透射材料能力的物理屬性。“光線”根據(jù)波長的不同可以分為紫外線、可見光以及紅外光譜等。
特定波長透明度的優(yōu)勢與相應(yīng)應(yīng)用有關(guān)。包括但不限于以下一些示例：
可見光透明度(400-700nm)
???? 光學(xué)顯微鏡成像
???? 培養(yǎng)狀態(tài)的目測檢查(如，污染情況或pH變化)
???? 熒光顯微鏡成像
UV-A透光性(320-400nm)
???? 光分離置換
???? 熒光顯微鏡成像
在上述操作中，透明的培養(yǎng)袋能夠避免進(jìn)行取樣或更換器皿，其不但可以減少工作量以及培養(yǎng)環(huán)境操控，還可消除可能的污染。
可提取物和浸出物
可提取和浸出物是用于描述各種條件下遷移化合物的術(shù)語。
可提取物物
可在標(biāo)準(zhǔn)條件下從接觸表面遷移的有機和無機化學(xué)物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)條件可能包括：
???? 較高溫度
???? 較長接觸時間
???? 標(biāo)準(zhǔn)溶劑
可提取物在儲存和使用條件下可以浸入產(chǎn)品中[17]。
浸出物
在特定應(yīng)用或“工況”條件下從接觸表面遷移的有機和無機化學(xué)物質(zhì)[17]。
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這些通常被視為可提取物的一種，但并非所有浸出物均要通過典型的提取測試進(jìn)行識別(圖5)。
圖5-可提取物與浸出物之間的關(guān)系。
由于浸出物與特定過程直接相關(guān)，因此不存在可供識別的通用測試。大多數(shù)情況下，采用多種溶劑的溶出測試以及足夠靈敏的分析工具可以用于表達(dá)遷移出的化合物。一些最常用的方法如表1所示.
表1- 常見的可提取物和浸出物分析方法概述[17]。
通常情況下，必須要能夠定量識別和確認(rèn)可能從塑料裝置上遷移出的雜質(zhì)并對細(xì)胞的生長和培養(yǎng)期間有潛在的風(fēng)險和和負(fù)面影響的危害。Amgen 在2013年檢測到即使少量遷移化合物也會造成影響。當(dāng)時，Amgen所研究的是聚烯烴中的常見抗氧化劑Irgafos?168對于幾種中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系生長的影響[18]。經(jīng)過對各種方案的徹底調(diào)查之后，Amgen通過與供應(yīng)商密切合作對原料中Irgafos的初始量進(jìn)行優(yōu)化，以此降低浸出化合物濃度，最終降低了這種不利影響[18]。?
除了對細(xì)胞培養(yǎng)的直接影響之外，另外還存在遷移出的化合物在藥物生產(chǎn)過程中污染下游工序的風(fēng)險，尤其是在沒有最終過濾工序情況下生產(chǎn)細(xì)胞治療藥物工序時。
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總結(jié)
在選擇細(xì)胞培養(yǎng)所使用的系統(tǒng)時，諸如滲透性、透明性和可提取物等材料特性均至關(guān)重要。除此之外，選擇適當(dāng)解決方案時還要考慮其他幾種材料和非材料特性。這些特性包括但不限于：
???? 封閉系統(tǒng)方案
???? 尺寸和形狀配置
???? 管件、端口和連接器類型
???? 無菌性和保質(zhì)期
本報告后續(xù)章節(jié)將概要列出氟化乙烯丙烯(FEP)(一種常見培養(yǎng)材料)的特性以及培養(yǎng)數(shù)據(jù)，以便對于關(guān)鍵材料特性與細(xì)胞培養(yǎng)性能之間的關(guān)系有一個經(jīng)驗上的把握。?
表2- FEP和EVA的透氧性
氟化乙烯丙烯的具體材料特性
FEP是一種經(jīng)過完全氟化的含氟聚合物，其所具備的多種固有材料特性非常適合用于包括細(xì)胞培養(yǎng)在內(nèi)的許多細(xì)胞療法應(yīng)用。本節(jié)提供的FEP相關(guān)數(shù)據(jù)與上述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的關(guān)鍵特性一致。?
所給出的所有性能數(shù)據(jù)均基于針對5 mil(0.127mm)薄膜的測量，該厚度為FEP培養(yǎng)容器的常用厚度。在滲透性方面，為了確立對比參考點，還對細(xì)胞培養(yǎng)常用的乙烯醋酸乙烯酯(EVA)薄膜進(jìn)行了測試。在此情況下，對8mil(0.203mm)薄膜進(jìn)行了測量，該厚度為EVA培養(yǎng)容器的普通厚度。
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透氧性
依照ASTM D3985要求使用MOCON OxTran 220 OTR分析儀在25℃和37℃條件對氧氣透過率(OTR)進(jìn)行測量(表3)。?
表3- FEP和EVA的水蒸汽滲透性。
FEP的透氧性可實現(xiàn)氧氣的大量滲透，足以滿足很多細(xì)胞培養(yǎng)過程中的代謝要求。
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水蒸汽滲透性
依照ASTM F1249要求使用MOCON Permatran W700水蒸氣分析儀對水蒸氣透過率(WVTR)進(jìn)行測量(表3)。
盡管FEP可以滲透氧氣，但卻能夠有效阻擋水蒸氣，通常無需通過加濕，避免培養(yǎng)箱內(nèi)的大量水分流失。這些從表4中的數(shù)據(jù)中即可看出。數(shù)據(jù)顯示了40°C非加濕烘箱中的六個注水FEP袋在14天內(nèi)的平均水分流失情況。(表4).?
表4- FEP袋內(nèi)的水分流失
可提取物
與大多數(shù)聚合物不同的是，FEP薄膜的擠出工藝不使用任何添加劑(如，抗氧化劑、增塑劑、加工助劑等)。作為經(jīng)過完全氟化的聚合物，其具有極高的固有穩(wěn)定性，且在水或其他溶劑中不會析出改性劑或其他物質(zhì)。因此，可提取物通常達(dá)到或低于檢測限(表5)。
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表5- FEP內(nèi)溶出物概況摘要
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測試結(jié)果基于兩個無菌2PF-0290 VueLife?FEP袋的匯總分析。以3cm2：1ml萃取比在70℃條件下在水或70％乙醇/30％水(容積百分比)中萃取24小時。
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透明度
使用PerkinElmer UV-Vis-NIR分光光度計上測量FEP光透射率。
FEP是透光性最高的塑料，透過其薄膜可以一覽無余。這對于形態(tài)學(xué)特征以及通過諸如酚紅等標(biāo)志物展示細(xì)胞環(huán)境的劇烈變化至關(guān)重要(表6)
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表6- FEP的透明度特性
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利用FEP培養(yǎng)體系進(jìn)行單核細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和分化
方法
單核細(xì)胞富集
按照制造商的說明使用Elutra(Terumo)細(xì)胞處理系統(tǒng)。簡而言之，將補充1％HSA(CSL)的HBSS(Lonza)連接至培養(yǎng)基系，將0.9％氯化鈉(Baxter)連接至第二培養(yǎng)基系，將新鮮的志愿者單采血漿(Key Biologics，TN)連接到Elutra一次性試劑盒的樣品輸入管線上。?
Elutra分離方案根據(jù)制造商說明操作，如表7所示
表7- Elutra分離方案細(xì)節(jié)
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單核細(xì)胞培養(yǎng)/分化
將含有大部分單核細(xì)胞的組分以800×g離心5分鐘，并完全懸浮在CellGenix GMP DC培養(yǎng)基中(以500U/ml GM-CSF和500U / ml IL-4(均為CellGenix)進(jìn)行補料)。將單位為100萬細(xì)胞/毫升的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至VueLife?160-C1培養(yǎng)袋(圣戈班的產(chǎn)品)。通過搖動/倒置方式將袋中的產(chǎn)品充分混合，然后置于標(biāo)準(zhǔn)的加濕培養(yǎng)箱(37℃，5％CO)內(nèi)7天。
第1、3、5和7天時將袋子從培養(yǎng)箱中取出，在倒置顯微鏡下觀察，并在充分混合后取出樣品。?
在第1天和第3天時，補充新鮮的樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基以確保取樣后體積沒有變化。在第5天時，向培養(yǎng)皿補充樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)基以及另外500ng/ml腫瘤壞死因子α(TNFα)(CellGenix)。在第7天時，停止培養(yǎng)并收集細(xì)胞進(jìn)行分析。
樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量按相對單核細(xì)胞起始數(shù)量的百分比計算。
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分析
取樣后立即在Nova pHOx生化分析儀上測量酸堿平衡和呼吸參數(shù)(pCO2、pO2和pH)。
第二個樣品在解凍以及在Cedex生化分析儀(Roche)上進(jìn)行乳酸、葡萄糖、谷氨酰胺和銨分析之前進(jìn)行冷凍。在AC* T DIFF?血液分析儀Beckman Coulter上進(jìn)行全血細(xì)胞計數(shù)(CBC)。
細(xì)胞計數(shù)和存活率測量在Chemometec的NucleoCounter-200上進(jìn)行，隨后在Gallios的BeckmanCoulter上對樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析(表9)。
使用FlowJo軟件進(jìn)行補償和分析。
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結(jié)論
細(xì)胞活性和產(chǎn)量
使用FEP袋進(jìn)行培養(yǎng)獲得相當(dāng)不錯的產(chǎn)量(60％)，圖5，左圖和活力(92％)，圖6，右圖為單核細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的預(yù)期值[19-21]。?
圖6- 利用VueLife培養(yǎng)袋進(jìn)行樹突狀細(xì)胞分化實驗的細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞活力
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表8- FACS板的樹突狀細(xì)胞分析
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Tuyaerts等評審強調(diào)，基于單核細(xì)胞富集方法獲得的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)量和純度變化很大，報告值分別為4-100％和1-20％[10]。經(jīng)過篩選后，單核細(xì)胞的回收率和純度趨于約90％，盡管分化為樹突狀細(xì)胞的過程存在差異，Eyrich報告產(chǎn)量為47％，標(biāo)準(zhǔn)偏差32％[11]，Adamson報告為42％，標(biāo)準(zhǔn)偏差13％[12]。
化學(xué)分析
化學(xué)分析表明pH、pO2和pCO2水平在培養(yǎng)過程中均保持一致，并與環(huán)境保持平衡(圖7)。樹突培養(yǎng)基的pH值為7.2，并在整個培養(yǎng)過程中始終保持不變，突出展示培養(yǎng)袋特性可以確保培養(yǎng)期間的恒定pH。培養(yǎng)過程中乳酸和銨鹽有所增加，而兩者均為細(xì)胞代謝副產(chǎn)品，因此表明細(xì)胞代謝活躍。由于在培養(yǎng)期間沒有更換培養(yǎng)基，因此預(yù)計兩種代謝物的含量均會增加。作為細(xì)胞死亡測量指標(biāo)的乳酸脫氫酶始終穩(wěn)定，表明培養(yǎng)期間不存在與細(xì)胞死亡水平增加相關(guān)的有害作用。培養(yǎng)期間作為細(xì)胞代謝輸入物的葡萄糖水平降低，而隨著活性細(xì)胞對該試劑的消耗而減少，正如預(yù)期。谷氨酸鹽是一種氨基酸，是細(xì)胞生長所必需的。谷氨酸鹽的水平超出預(yù)計量的下降是因為培養(yǎng)基固有的不穩(wěn)定性，并且與葡萄糖和總蛋白的下降一致，這些均表明存在活躍的細(xì)胞代謝。
其他化學(xué)物質(zhì)(乳酸、銨、葡萄糖、谷氨酰胺、LDH和總蛋白)均在單核細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的預(yù)期值范圍內(nèi)(圖8)。
圖7- 樹突細(xì)胞分化實驗的pH、pO2和pCO2測量
N=3。使用Nova pHOx生物分析儀對新鮮樣品進(jìn)行測量。
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圖8- 樹突狀細(xì)胞分化實驗中的乳酸、葡萄糖、銨、谷氨酰胺、LDH和總蛋白測量。
N=3。使用Roche Cedex生化分析儀對冷凍樣品進(jìn)行測量。?
表型分析
通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行的表型分析表明分化過程中細(xì)胞的大小和復(fù)雜性均有增加(前向和側(cè)向增加) (圖9)。到第7天時，CD14表達(dá)的敲除基本完成。培養(yǎng)期間觀察到與樹突狀細(xì)胞分化和成熟相關(guān)的標(biāo)志物表達(dá)均有增加。在這些標(biāo)志物中，CD86和HLA-DR表達(dá)在第0天初始單核細(xì)胞中成分較高，但在分化過程中仍然進(jìn)一步增加。CD40、CD1a、CD80和CD83在第0天時基本上不存在，但在分化過程結(jié)束時顯著增加，并且CD1a和CD80變化幅度最大。?
總結(jié)
本文所做的研究表明，使用FEP袋進(jìn)行單核細(xì)胞到樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)和分化所產(chǎn)生的效果與使用其他器皿的值一致。產(chǎn)量(60％)和活力(92％)與先前報告的值相當(dāng)。化學(xué)分析表明，通過提供根據(jù)pO2、pCO和pH測量的大量氣體交換，FEP袋的特性能夠?qū)?xì)胞環(huán)境進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂啤４x物數(shù)據(jù)表明細(xì)胞存在活躍代謝，即細(xì)胞在FEP袋內(nèi)處于健康狀態(tài)。細(xì)胞表型表明隨著時間變化，從第1天的較大的單核細(xì)胞群體(通過CD14標(biāo)志物顯示)變?yōu)榈?/span>7天的未成熟樹突狀細(xì)胞群體(CD14+敲除小于10％且CD40+，CD83+，CD86+和HLA-DR+大于75％)。?
結(jié)論
在選擇細(xì)胞培養(yǎng)容器時，除了傳統(tǒng)的“生物相容性”外，還需要考慮更多因素。
所需要的某些材料屬性在本文中概括如下：
???? 氣體和水蒸汽滲透性
???? 透明度
???? 溶出物特征
此外，在選擇成品培養(yǎng)容器時需要考慮多個方面。其中包括以下因素：
???? 該容器是否可視為密閉系統(tǒng)？
???? 存在哪些尺寸和形狀可供選用？
???? 有哪些管件、端口和連接器可供選用？
???? 產(chǎn)品如何消毒？
????????? 產(chǎn)品保質(zhì)期如何？
根據(jù)關(guān)鍵材料特性，由FEP制成的VueLife?被確認(rèn)為是單核細(xì)胞培養(yǎng)和分化的合適選擇。然而，鑒于細(xì)胞療法市場中的生產(chǎn)和細(xì)胞類型多樣性，很少有適用所有細(xì)胞培養(yǎng)過程一勞永逸的解決方案。為了確保材料的正確選型并根據(jù)特定生產(chǎn)需求完成設(shè)計，盡早與供應(yīng)商展開討論非常重要。
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圖9- 7天培養(yǎng)期間從單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程中的細(xì)胞表型
?A)???? 根據(jù)第0天頂部、第5天中部和第7天底部在培養(yǎng)期內(nèi)尺寸和復(fù)雜性增加的前向和側(cè)向?qū)Ρ龋跏籍a(chǎn)物擁有12％粒細(xì)胞，數(shù)據(jù)未顯示。
B)???? CD40、CD1a、CD80和CD83中的表達(dá)增加，同時CD86和HLA-DR表達(dá)不變。隨著時間的推移，群體失去CD14+CD66b
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